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??? 隨著生物制藥以及診斷試劑領(lǐng)域?qū)慰寺】贵w ( mAbs ) 的需求日益旺盛，需要更大量、更高純度的抗體產(chǎn)品。因此，通過層析法實現(xiàn)抗體的下游純化變得日趨重要。

??? 各種模式中，蛋白A親和層析法可獲得高純度的單抗，因此普遍用于初始純化步驟（即初期捕獲）中。離子交換層析法 ( IEC ) 的高載量特點也使之在抗體的制備純化中被廣泛采用。疏水相互作用層析法 ( HIC ) 具有去除抗體多聚體以及脫落的蛋白 A 配體等雜質(zhì)的性能。混合模式層析法（MXC，含羥基磷灰石類分離介質(zhì)）也被運用到了抗體的層析純化工藝之中。

采用蛋白A親和層析法的純化工藝

??? 采用蛋白A親和層析法的純化工藝是指第一步捕獲使用蛋白A親和層析，其后步驟使用其他層析模式去除諸如宿主細胞蛋白、核酸、抗體多聚體和脫落的蛋白A配體等雜質(zhì)的方法。工藝中如果選用陰離子交換層析法（包括陰離子交換膜層析法），則是通過目標抗體流穿或吸附并去除雜質(zhì)而達到純化抗體的目的。


??? 圖 1.????? 采用了蛋白A親和層析法的純化工藝示例

不采用蛋白A親和層析法的純化工藝

??? 不采用蛋白A親和層析法的純化工藝可降低工藝成本。可通過結(jié)合使用陽離子交換層析法 ( CEX ) 、陰離子交換 層析法 ( AEX ）、疏水相互作用層析法 ( HIC ) 以及混合模式層析法 ( MXC ) 實現(xiàn)對單抗的高純度純化制備。

??? 圖 2.????? 不采用蛋白A親和層析法的純化工藝示例

表1. 用于單抗純化的 Toyopearl 產(chǎn)品舉例

蛋白A親和層析填料（耐堿、高載量 / 高流速型）

??? 蛋白A填料在單抗純化工藝中具有載量高，處理速度 快等眾多優(yōu)勢，非常適合用于單抗純化的捕獲階段。

?????? TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F 是東曹推出的新型的耐堿型、高載量蛋白 A 填料，即使是高滴度、高濃度（10 g/L）的單抗樣品，在常用流速下也具有非常高的動態(tài)載量。

?????? TOYOPEARL AF-rProtein A-650F作為老一代的蛋白A產(chǎn)品，可以在高流速（柱留時間 1 min）下進行樣品的處理。東曹的填料機械強度高，在柱高為 20-30 cm 的情況下，仍然可以使用高流速的條件進行分離（線性流速500-1000 cm/h），同時保持較高的動態(tài)載量，從而提高抗體純化工藝的生產(chǎn)效率。

?????? TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F 和 AF-rProtein A 650F 是將新的耐堿型蛋白A配體多位點結(jié)合到填料基體上，對鼠 IgG1、IgM 以及 Fab 具有很強的親和力。并且在 堿性條件下多次CIP 循環(huán)后，吸附載量也不會降低。

離子交換層析填料（高載量、強耐堿型）

??? 隨著官能團鍵合技術(shù)的進步，目前主流的離子交換填料對于抗體的吸附載量一般都能打到 100-170 g/L。抗體 的等電點一般為中性或者弱堿性，所以陽離子交換填料在抗體的純化工藝中一般適用于吸附 - 洗脫模式。

???????TOYOPEARL GigaCap S-650M 對抗體的動態(tài)載量 非常高，通過優(yōu)化洗脫液，在 1000 cm/h 的線性流速下，動態(tài)載量約為90 g/L，并且可以得到與蛋白 A 填料相媲美的純度。

????陰離子交換填料在抗體的純化工藝中一般通過流穿模式來去除樣品中的宿主細胞蛋白、核酸、內(nèi)毒素、多聚體等雜質(zhì)。? TOYOPEARL GigaCap Q-650M、TOYOPEARL Q-600C AR、TOYOPEARL NH2 -750F 等，均是高載量型的優(yōu)異層析填料。

?????? TOYOPEARL 離子交換填料不僅對抗體有著較高的載量，在洗脫時，抗體的洗脫峰型尖銳、不拖尾的特點也減少了工藝中樣品的處理時間，提高生產(chǎn)效率。

??? 培養(yǎng)的上清液中如果含有鹽（0.1-0.15 mol/L），可以使 用 TOYOPEARL GgiaCap CM-650M、TOYOPEARL Q-600C AR、TOYOPEARL NH2-750F 具有鹽耐性的填料 進行直接上樣分離。

混合模式層析填料（高載量型）

??? 此類填料的官能團即具有離子性，又具有疏水性。混合模式填料對于含有一定鹽濃度（0.15 mol/L NaCl）的單抗樣品可以進行直接上樣，進行吸附和洗脫分離。

?????? TOYOPEARL MX-Trp-650M 的官能團為色氨酸，對抗體具有非常高的動態(tài)載量（70 g/L 以上）。相比于蛋白 L 填料，對抗體片段（Fab）和單體（scFv）都有著更高的動態(tài)載量。

疏水層析填料（高載量型）

??? 疏水相互作用層析法不僅可以分離諸如宿主細胞蛋白、核酸、脫落的蛋白 A 配體等雜質(zhì)，還可以分離抗體的多聚體和異構(gòu)體。

被稱為第二代疏水層析填料的 TOYOPEARL 600 系列產(chǎn)品，通過優(yōu)化填料的孔徑從而大大提高了對單抗的吸附載量。抗體的動態(tài)吸附載量一般為20-45 g/L，但是我們需要通過抗體的疏水性、回收率、分辨率等條件來選擇最優(yōu)的疏水填料。一般而言，苯基和丁基（TOYOPEARL Phenyl-650M、Phenyl-600M、Butyl-650M、Butyl-600M）適用于單抗的分離，但是對于疏水性比較強的抗體則需要選擇疏水性比較弱的 TOYOPEARL PPG-600M疏水填料。最新的研究中，有使用混合鹽溶液（Dual salts）來提高吸附載量的案例，TOYOPEARL Hexyl-650C 在流穿模式的運用，TOYOPEARL Phenyl-650、Butyl-650、 PPG-600、Ether-650M 等也被運用在 ADC 藥物的分離 純化中。

工藝開發(fā)、篩選用預(yù)裝柱（ToyoScreen產(chǎn)品）

?????? ToyoScreen篩選用預(yù)裝柱（1 ml裝及5 ml裝）包括各種層析模式，可用于層析填料的篩選、精制純度和回收率的研究以及層析條件的優(yōu)化工作等方面。與HPLC或MPLC 系統(tǒng)連用可簡單地對抗體的分離效果進行評估。

高速分離、高分辨率、小粒徑填料 （離子交換填料、疏水填料）

??? 使用離子交換或疏水填料分離異構(gòu)體的時候，對分辨率要求特別高的情況下，可以使用粒徑為20-30 μm的小粒徑填料例如TSKgel PW系列，或者TOYOPEARL GigaCap Q-650S和GigaCap S-650S來進行純化分離。

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????? ?圖3. 單克隆抗體多聚體的分離

? 圖4. 抗體純化的工藝平臺示例 ：AFC-CIEC-HIC